Biópsias líquidas usam sangue - não tecido tumoral - para diagnosticar câncer
Tipicamente, os tumores são examinados usando biópsias de tecido. Uma pequena amostra é retirada do tumor e genotipada, ou analisada para composição genética. O problema com essa abordagem é que os tumores de biópsia podem ser desafiadores. Além disso, uma biópsia do tumor fornece apenas um instantâneo do tumor.
Escrevendo no Discovery Medicine em 2015, Labgaa e co-autores afirmam o seguinte sobre a biópsia convencional do tumor:
Por razões óbvias, é difícil monitorar a evolução do tumor por meio de biópsias sequenciais. Além disso, a biópsia apenas espelha uma única mancha do tumor e, portanto, é improvável que represente todo o espectro de mutações somáticas em grandes tumores. Uma alternativa seria obter múltiplas biópsias para o mesmo tumor, mas essa opção parece não ser realista nem precisa.
A biópsia líquida envolve a medição do DNA circulante (ctDNA) e outros subprodutos do tumor em amostras de sangue obtidas de pacientes com câncer. Essa abordagem diagnóstica emergente promete ser rápida, não invasiva e econômica.
História da Biópsia Líquida
Em 1948, Mandel e Métais, um par de pesquisadores franceses identificaram pela primeira vez o ctDNA no sangue de pessoas saudáveis. Esta descoberta foi à frente de seu tempo, e não foi até décadas depois que o ctDNA foi mais explorado.
Em 1977, Leon e seus colegas identificaram pela primeira vez quantidades aumentadas de ctDNA no sangue de pacientes com câncer.
Em 1989, Stroun e seus colegas identificaram características neoplásicas (ou seja, câncer) no sangue. Após essas descobertas, vários outros grupos identificaram mutações específicas em supressores de tumor e oncogenes, instabilidade de microssatélites e metilação do DNA, o que provou que o ctDNA é liberado na circulação por tumores.
Embora saibamos que o ctDNA derivado de células tumorais circula no sangue, a origem, a taxa de liberação e o mecanismo de liberação deste DNA não são claros, com pesquisas produzindo resultados conflitantes. Algumas pesquisas sugerem que tumores mais malignos contêm mais células cancerosas mortas e liberam mais ctDNA. No entanto, algumas pesquisas sugerem que todas as células liberam ctDNA. No entanto, parece provável que tumores cancerígenos liberem níveis aumentados de ctDNA no sangue, tornando o ctDNA um bom biomarcador de câncer.
Devido à fragmentação pesada e baixas concentrações no sangue, o ctDNA é difícil de isolar e analisar. Existe uma discrepância entre as concentrações de ctDNA entre as amostras de soro e plasma. Parece que o soro sanguíneo, e não o plasma sanguíneo, é uma melhor fonte de ctDNA. Em um estudo de Umetani e colegas, verificou-se que as concentrações de ctDNA eram consistentemente baixas no plasma em comparação com o soro devido à possível perda de DNA circulante durante a purificação, pois a coagulação e outras proteínas estão sendo eliminadas durante a preparação da amostra.
De acordo com Heitzer e colegas, aqui estão algumas questões específicas que precisam ser resolvidas para aproveitar o potencial de diagnóstico do ctDNA:
Primeiro, os procedimentos pré-analíticos precisam ser padronizados…. A seleção de um método de isolamento que garanta a extração de uma quantidade suficiente de DNA de alta qualidade é fundamental e tem sido demonstrado que fatores pré-analíticos de amostragem e processamento de sangue podem afetar fortemente o rendimento do DNA…. Em segundo lugar, uma das questões mais importantes é a falta de harmonização dos métodos de quantificação. Diferentes métodos de quantificação, ... produzem resultados diferentes porque estas medições têm como alvo DNA total ou apenas amplificável…. Terceiro, menos se sabe sobre a origem e o mecanismo detalhado da liberação de ctDNA e, na maioria dos estudos, confundem eventos que também podem contribuir para a liberação de ctDNA.
Abordagens direcionadas versus não direcionadas
Atualmente, existem duas abordagens principais quando se analisa o plasma sanguíneo (ou soro) do ctDNA. A primeira abordagem é direcionada e procura por alterações genéticas específicas indicativas de tumores. A segunda abordagem é untargeted e envolve uma análise genoma-wide procurando ctDNA reflexivo do câncer. Como alternativa, o sequenciamento do exoma tem sido usado como uma abordagem mais econômica e sem segmentação. Exomes são as partes do DNA que são transcritas para produzir proteína.
Com abordagens direcionadas, o soro é analisado em busca de mutações genéticas conhecidas em um pequeno conjunto de mutações condutoras.
Mutações de motorista se referem a mutações no genoma que promovem, ou “impulsionam”, o crescimento de células cancerígenas. Essas mutações incluem KRAS ou EGFR .
Devido aos avanços tecnológicos nos últimos anos, abordagens direcionadas para a análise do genoma de pequenas quantidades de ctDNA tornaram-se viáveis. Essas tecnologias incluem o ARMS (sistema de mutação refratária de amplificação); PCR digital (dPCR); contas, emulsões, amplificação e magnetismo (BEAMing); e sequenciamento profundo (CAPP-Seq).
Embora tenha havido avanços na tecnologia que possibilitam a abordagem direcionada, a abordagem direcionada apenas atinge algumas posições de mutações (pontos de acesso) e perde muitas mutações de driver, como genes supressores de tumor.
O principal benefício de abordagens não direcionadas à biópsia líquida é que elas podem ser usadas em todos os pacientes devido ao fato de que o teste não depende de alterações genéticas recorrentes. Mudanças genéticas recorrentes não cobrem todos os cânceres e não são assinaturas específicas de câncer. No entanto, esta abordagem carece de sensibilidade analítica e uma análise abrangente dos genomas do tumor ainda não é possível.
É digno de nota que o preço do sequenciamento de um genoma inteiro caiu substancialmente. Em 2006, o preço do sequenciamento do genoma inteiro foi de aproximadamente US $ 300.000 (USD). Em 2017, o custo caiu para aproximadamente US $ 1.000 por genoma, incluindo reagentes e a amortização de máquinas de seqüenciamento.
Utilidade Clínica da Biópsia Líquida
Os esforços iniciais para usar o ctDNA foram diagnósticos e compararam os níveis em pacientes saudáveis com aqueles de pacientes com câncer ou com doença benigna. Os resultados desses esforços foram mistos, com apenas alguns estudos mostrando diferenças significativas indicando câncer, estado de doença ou recaída.
A razão pela qual ctDNA pode ser usado apenas um pouco do tempo para diagnosticar o câncer é porque as quantidades variáveis de ctDNA são derivados de tumores. Nem todos os tumores “perdem” o DNA na mesma quantidade. Em geral, os tumores mais avançados e disseminados lançam mais DNA na circulação do que tumores localizados precocemente. Além disso, diferentes tipos de tumores liberam diferentes quantidades de DNA na circulação. A fração de DNA circulante que é derivada de um tumor é amplamente variável entre estudos e tipos de câncer, variando de 0,01% a 93%. É importante notar que, em geral, apenas uma minoria do ctDNA é derivada do tumor, sendo o restante proveniente de tecidos normais.
O DNA circulante poderia ser usado como um marcador prognóstico da doença. O DNA circulante pode ser usado para monitorar mudanças no câncer ao longo do tempo. Por exemplo, um estudo mostrou que a taxa de sobrevida de dois anos em pacientes com câncer colorretal (ou seja, o número de pacientes ainda vivos pelo menos dois anos após o diagnóstico de câncer colorretal) e as mutações do hotspot KRAS foi de 100% naqueles sem evidência de DNA circulante correspondente. Além disso, é possível que, num futuro próximo, o DNA circulante possa ser usado para monitorar lesões pré-cancerosas.
O DNA circulante também pode ser usado para monitorar a resposta à terapia. Como o DNA circulante oferece um melhor quadro geral da composição genética dos tumores, esse DNA provavelmente contém DNA diagnóstico, que pode ser usado em vez do DNA diagnóstico obtido a partir dos próprios tumores.
Agora, vamos dar uma olhada em alguns exemplos específicos de biópsia líquida.
Guardant360
A Guardant Health desenvolveu um teste que usa o sequenciamento de próxima geração para identificar o DNA circulante em busca de mutações e rearranjos cromossômicos para 73 genes relacionados ao câncer. A Guardant Health publicou um estudo relatando a utilidade da biópsia líquida em oncologia. O estudo utilizou amostras de sangue de 15.000 pacientes com 50 tipos de tumores combinados.
Na maioria dos casos, os resultados do teste de biópsia líquida estão alinhados com as alterações gênicas observadas em biópsias tumorais.
De acordo com o NIH:
O Guardant360 identificou as mesmas mutações críticas em importantes genes relacionados ao câncer, como EGFR, BRAF, KRAS e PIK3CA, em frequências muito semelhantes às identificadas anteriormente em amostras de biópsia tumoral, correlacionando-se estatisticamente a 94% a 99%.
Além disso, de acordo com o NIH, os pesquisadores relataram o seguinte:
Em um segundo componente do estudo, os pesquisadores avaliaram cerca de 400 pacientes - a maioria dos quais tinha câncer de pulmão ou colorretal - que tinham disponíveis tanto o DNA do ctDNA quanto o tecido tumoral e compararam os padrões de alterações genômicas. A precisão geral da biópsia líquida em comparação com os resultados das análises de biópsia do tumor foi de 87%. A precisão aumentou para 98% quando as amostras de sangue e tumor foram coletadas dentro de 6 meses uma da outra.
O Guardant360 foi preciso, embora os níveis de DNA circulante no sangue fossem baixos. Muitas vezes, o DNA do tumor circulante só compõe 0,4 por cento do DNA no sangue.
No geral, usando biópsia líquida, os pesquisadores do Guardant foram capazes de identificar marcadores tumorais que poderiam direcionar o tratamento por médicos em 67% dos pacientes. Esses pacientes eram elegíveis para tratamentos aprovados pela FDA, bem como para terapias de investigação.
ctDNA e câncer de pulmão
Em 2016, o FDA aprovou o teste cobas EGFR Mutation Test para ser usado na detecção de mutações do EGFR no DNA circulante de pacientes com câncer de pulmão. Este teste foi a primeira biópsia líquida aprovada pelo FDA e identificou pacientes que podem ser candidatos ao tratamento com terapias direcionadas usando erlotinibe (Tarceva), afatinibe (Gilotrif) e gefitinibe (Iressa) como tratamento de primeira linha, e osmeroitinibe (Tagrisso) como tratamento de segunda linha. Essas terapias direcionadas atacam células cancerígenas com mutações específicas do EGFR .
É importante ressaltar que, devido ao alto número de resultados falso-negativos, a FDA recomenda que uma amostra de biópsia de tecido também seja retirada de um paciente que tenha uma biópsia líquida negativa.
ctDNA e Câncer de Fígado
O número de pessoas que morreram de câncer de fígado aumentou nos últimos 20 anos. Atualmente, o câncer de fígado é a segunda principal causa de morte por câncer no mundo. Não há bons biomarcadores disponíveis para detectar e analisar câncer de fígado ou hepatocelular (HCC). O DNA circulante pode ser um bom biomarcador para o câncer de fígado.
Considere a seguinte citação de Lagbaa e co-autores sobre o potencial do uso de DNA circulante para diagnosticar o câncer de fígado:
A hipermetilação de RASSF1A, p15 e p16 tem sido sugerida como ferramentas de diagnóstico precoce em um estudo retrospectivo incluindo 50 pacientes com CHC. Uma assinatura de quatro genes metilados aberrante (APC, GSTP1, RASSF1A e SFRP1) também foi testada quanto à precisão diagnóstica, enquanto a metilação do RASSF1A foi relatada como um biomarcador prognóstico. Estudos subseqüentes analisaram o ctDNA em pacientes com CHC utilizando tecnologias de sequenciamento profundo. Surpreendentemente, números aberrantes de cópias de DNA foram detectados em dois portadores de HBV sem história prévia de CHC no momento da coleta de sangue, mas que desenvolveram CHC durante o acompanhamento. Esta descoberta abriu as portas para avaliar a variação do número de cópias no ctDNA como uma ferramenta de triagem para detecção precoce de HCC.
Uma palavra de
As biópsias líquidas são uma nova abordagem interessante para o diagnóstico genômico. Atualmente, certas biópsias líquidas, que oferecem perfil molecular abrangente, estão disponíveis para os médicos para complementar a informação genética obtida da biópsia de tecido. Existem também algumas biópsias líquidas que podem ser usadas no lugar da biópsia do tecido - quando as biópsias de tecido não estão disponíveis.
É importante ter em mente que muitos ensaios com biópsias líquidas estão em andamento e mais pesquisas precisam ser feitas para detalhar a utilidade terapêutica dessa intervenção.
> Fontes:
> Teste de sangue para alterações genéticas em tumores mostra a promessa como alternativa à biópsia de tumor. NIH
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. DNA de tumor circulante como uma biópsia líquida para câncer. Química Clínica. 2015; 61: 112–123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Biópsia líquida em câncer de fígado. Medicina Descoberta. 2015; 19 (105): 263-73.
> Biópsia líquida: usando DNA no sangue para detectar, rastrear e tratar o câncer. NIH
> Umetani N, et al. Maior quantidade de DNA circulante livre no soro do que no plasma não é causada principalmente por DNA estranho contaminado durante a separação. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Princípios Gerais na Farmacoterapia do Câncer. Em: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13e Nova Iorque, NY: McGraw-Hill.